有關工程化的神經(jīng)干細胞的研究進展論文
1992年Reynolds等[1]首次從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出能夠自我更新的多潛能細胞群落，首此提出神經(jīng)干細胞(Neural stem cells，NSCs)的概念。由于神經(jīng)干細胞具備自我更新能力和多分化潛能的生物學特性，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治愈帶來了新的希望。隨著神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)技術的日漸成熟，并伴隨著基因工程技術飛速發(fā)展，研究者們可根據(jù)不同的科研目的，對神經(jīng)干細胞進行不同的基因工程改造，工程化的神經(jīng)干細胞隨之孕育而生。
1 工程化神經(jīng)干細胞的構建
工程化神經(jīng)干細胞移植治療技術是目前治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病最具前景的治療方法之一。研究者們通過基因工程技術，將不同的目的基因片段成功構建于脂質(zhì)體或病毒載體上，之后再將其成功導入神經(jīng)干細胞，這種受基因調(diào)控神經(jīng)干細胞比其他普通干細胞在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病上具有優(yōu)勢。目前神經(jīng)干細胞工程化的研究主要表現(xiàn)在以下幾個方面：(1)神經(jīng)干細胞作為治療基因的載體，在其中插入不同目的基因的基礎片段，使神經(jīng)干細胞的功能性細化，與轉入的目的基因產(chǎn)生協(xié)同效果，達到更有效的治療效果;(2)可示蹤的神經(jīng)干細胞，通過基因工程將某些可示蹤的報告基因成功導入神經(jīng)干細胞中，標記將要進行移植的神經(jīng)干細胞，使移植后的神經(jīng)干細胞在體內(nèi)增殖、分化等過程更為有利地、直觀地觀察和研究;(3)永生化的神經(jīng)干細胞，通過基因技術的改造，阻止神經(jīng)干細胞的分化，使細胞在空間上處于未分化狀態(tài)，并使細胞體外傳代能力得到提高，永生化神經(jīng)干細胞不僅提高了移植治療的安全性及高效性，同時符合倫理道德研究，為神經(jīng)干細胞研究提供了更為寬廣的平臺。
1.1 基因治療的工程化神經(jīng)干細胞
中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病原因主要由于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中某種特定的細胞先天性發(fā)育不良、后天損傷以及退行性變甚至死亡，這些原因造成神經(jīng)系統(tǒng)中細胞難以或不能分泌功能性的細胞因子及神經(jīng)組織結構的破壞。基因治療技術開始于20世紀70年代，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展基因治療技術已經(jīng)得到長足的進步。研究者們利用基因治療技術，并整合神經(jīng)干細胞的生物特性，充分運用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，攜帶目的基因的神經(jīng)干細胞移植進病患體內(nèi)，起到基因修復、基因置換及基因增強的作用，恢復因為疾病所造成的細胞、組織或器官的生理功能缺陷。目前以神經(jīng)干細胞為靶細胞基因治療主要包括，一是以調(diào)控神經(jīng)干細胞的分化功能為主，導入神經(jīng)干細胞的目的基因在移植體中可控制細胞向所缺失的細胞方向分化。二是以基因修復或置換為主，在基因治療過程當中，在不涉及移植體中其他基因組的改變，矯正基因的異常序列達到治療的效果。最后是以神經(jīng)干細胞導入具有基因增強效果的目的基因，修復以破壞的神經(jīng)組織，并分泌各種細胞因子，以保護神經(jīng)系統(tǒng)。神經(jīng)干細胞基因治療始于治療帕金森病，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的開端和代表，Anton等成功構建了酪氨酸羥化酶為目的基因神經(jīng)干細胞，并將其移植進帕金森病模型大鼠的紋狀體中，實驗結果顯示構建的神經(jīng)干細胞對帕金森病治療效果明顯并無明顯異常表現(xiàn)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病方面，Klose等用轉染白介素-10基因的神經(jīng)干細胞治療自身免疫性腦脊髓炎，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞可作為白介素-10的穩(wěn)定載體，使白介素-10成功表達，同時調(diào)節(jié)T細胞改善疾病的病程。對于神經(jīng)干細胞分化、增殖方面，宋川等采用PCR、分子克隆與測序技術成功構建CDK52pEGFP表達質(zhì)粒，后將CDK52基因片段成功轉染入體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中，研究顯示CDK52成功表達后對神經(jīng)干細胞具有明顯的促分化后神經(jīng)細胞的軸突生長、形態(tài)成熟，細胞分化明顯、細胞多數(shù)為典型的神經(jīng)元樣或膠質(zhì)細胞樣。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、壞死性疾病方面，汪雷等采用NEP1-40作為靶基因，神經(jīng)干細胞作為載體細胞，在體外成功建立了能表達NEP1-40的神經(jīng)干細胞，將神經(jīng)干細胞轉入脊髓損傷大鼠模型并通過行為學判斷對脊髓損傷的影響，結果顯示基因修飾后的干細胞能夠進一步提高脊髓損傷恢復效果。Kim 等應用逆轉錄病毒作載體將VEGF轉至神經(jīng)干細胞并移植到大鼠脊髓損傷部位，發(fā)現(xiàn)轉染細胞6周后神經(jīng)干細胞增殖明顯，多數(shù)分化為成熟的少突膠質(zhì)細胞，并且VEGF在治療中增加了脊髓損傷部位的.血管密度及增強了神經(jīng)組織的保護作用。在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤方面，閆超等利用慢病毒介導的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV7-TK)融合基因轉染神經(jīng)干細胞，并將神經(jīng)干細胞植入C6膠質(zhì)瘤動物模型體中，觀察發(fā)現(xiàn)植入神經(jīng)干細胞的實驗組較對照組腫瘤體積有明顯的縮小，轉染了CK-TK 基因的神經(jīng)干細胞對膠質(zhì)瘤細胞有抑制作用，與其他單一自殺基因相比抗腫瘤效果更佳明顯。Karen等利用神經(jīng)干細胞向膠質(zhì)瘤細胞定向遷移能力且抑制腫瘤生長的特性，構建了具有胞嘧啶脫氨酶(CD)基因片段的神經(jīng)干細胞，并與5-氟胞嘧啶聯(lián)合移植入動物模型體內(nèi)，病理結果顯示神經(jīng)干細胞核型正常且抑制腫瘤組織生長效果明顯，這種聯(lián)合移植對于5-氟胞嘧啶安全性更加穩(wěn)定。中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的演變過程極為的復雜，在不同的演變過程當中，不同的基因在其水平范圍內(nèi)起到的效果也不盡相同。基因工程改造的神經(jīng)干細胞作為治療疾病的新型技術，能整合于神經(jīng)干細胞上的目的基因主要集中在細胞周期調(diào)節(jié)因子、腫瘤壞死因子、腫瘤信號轉導因子等。目前，能夠與目的基因成功的整合成功是神經(jīng)干細胞工程化的現(xiàn)階段研究重點。
1.2 可示蹤的工程化神經(jīng)干細胞
在神經(jīng)干細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，干細胞在活體中所起到的效用作用是顯著的，但論其治療過程如神經(jīng)干細胞在移植體中存活、遷移、分化等情況還不盡完善，合適的示蹤劑能夠幫助研究者們在無創(chuàng)性條件下識別及監(jiān)測神經(jīng)干細胞治療的過程及機制。神經(jīng)干細胞導入可標志性的基因片段，能夠很好地觀測移植后神經(jīng)干細胞治療過程的生物學變化。常用的標志基因主要有大腸桿菌乳糖操縱子中的β-半乳糖苷酶(LacZ)、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)。研究表明逆轉錄病毒中可以插入LacZ、GFP等標記分子，通過感染分裂期的細胞，使標志基因得以表達，這樣就可以對神經(jīng)干細胞的增殖、遷移、分化的全部過程進行監(jiān)測。其中以熒光蛋白標記GFP 應用較多，1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細胞中表達了能發(fā)射綠色熒光的GFP，開創(chuàng)了GFP研究與應用先河。近年來，研究發(fā)現(xiàn)MRI對示蹤活體神經(jīng)干細胞的分辨能力具有較強的表現(xiàn)，但在實際工作中發(fā)現(xiàn)某些疾病與正常組織的T1甚至T2弛像時間無明顯差別或差別不明顯，另外，雖然有些病變異常信號表達較高，但診斷與鑒別診斷仍較困難，這些情況下就需要應用MR增強劑。超順磁性氧化鐵和超小順磁性氧化鐵可在體外標記神經(jīng)干細胞，這種示蹤劑具有一種獨特的性質(zhì)--超順磁性，通過其獨有的性質(zhì)對神經(jīng)干細胞進行標記，并利用MRI顯像技術就可對神經(jīng)干細胞移植治療的過程進行全程觀測。國內(nèi)有研究表明在構建后的帕金森大鼠模型中植入被超順磁性氧化鐵標記的神經(jīng)干細胞，移植1周后MRI顯像上可見移植區(qū)的變化呈低信號;10周后，移植區(qū)低信號表現(xiàn)在T2梯度回波仍可被觀察到，證明了利用示蹤劑超順磁性氧化鐵所標記的神經(jīng)干細胞，在MRI顯像上能夠清晰地顯示出其分布和存活情況。除去以上標記神經(jīng)干細胞方法外，常用的標記方法還有利用細胞核中插入DNA 雙鏈染料，非分離細胞的標記技術，Y染色體標記等方法。盡管在可示蹤工程化神經(jīng)干細胞上取得許多的進展，但在無創(chuàng)性條件下利用影像學技術依舊不能很好的從細胞水平顯示神經(jīng)干細胞治療的全部過程。
1.3 永生化神經(jīng)干細胞
永生化指的是在細胞發(fā)展的過程當中，利用基因工程化技術使細胞周期的連續(xù)性得以保存。通過體外基因調(diào)控神經(jīng)干細胞得以永生化，其最常用的方法是將編碼后的癌基因蛋白的部分基因片段利用逆轉錄病毒載體轉導入胚胎神經(jīng)干細胞中，細胞終末分化被阻止，在空間上處于未分化狀態(tài)，細胞的傳代能力被提高。目前證實不同部位、不同年齡結構的神經(jīng)干細胞，通過轉入不同形式的myc、nen、p53、腺病毒EIA以及SV40大T抗原使其具有永生化。細胞的自發(fā)性永生化幾率非常小，人類細胞的__永生化幾率更是罕見。因此，研究者們努力提高永生化的發(fā)生率，利用基因轉染等技術手段，主要將各種外源性永生化基因導入靶細胞當中例如病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等達到細胞永生化的目的。端粒是存在于染色體末端，有重復的TTAGGG序列，它具有防止染色體降解、端端融合、重排和染色體丟失等功能，研究者們對多種永生細胞的端粒長度檢測時發(fā)現(xiàn)，永生化細胞分裂過程當中其端粒并未出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象，這有可能提示細胞增殖能力的無限化可能與端粒長度的維持有某種必然的聯(lián)系，這為神經(jīng)干細胞永生化提供了相對的理論機制。神經(jīng)干細胞具有良好的多分化潛能，而永生化的神經(jīng)干細胞是否能夠依然保持這種良好的特性。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)永生化神經(jīng)干細胞制備主要是通過利用溫度敏感型突變SV40大T抗原，然而分析表明這種制備的永生化神經(jīng)干細胞，癌基因的表達不能夠被充分地下調(diào)，如果去嘗試使細胞最終分化將會導致細胞的凋亡。因此，在構建永生化神經(jīng)干細胞時，若能充分下調(diào)癌基因的表達并使其具有可調(diào)控性是十分重要的，同時我們又要考慮到神經(jīng)干細胞的分化情況，若能構建不需要營養(yǎng)生長因子而能使細胞分化為目的細胞的系統(tǒng)那就更為的理想。Hoshimarn等使用了四環(huán)素控制的基因表達系統(tǒng)，通過逆轉錄病毒載體構建了LINXVmyc，并穩(wěn)定轉染于體外分離培養(yǎng)的成年鼠海馬神經(jīng)干細胞，這種神經(jīng)干細胞在體外可以穩(wěn)定地轉染克隆，v-myc轉錄是可被四環(huán)素所調(diào)節(jié)的，當在細胞培養(yǎng)液中添加四環(huán)素后，本身分裂的細胞停止分裂，并且在添加四環(huán)素5 d后，NFH 陽性的細胞占絕大多數(shù)，tau陽性細胞半數(shù)以上，Vimentin為陰性，這些現(xiàn)象說明癌基因表達可被低濃度四環(huán)素所調(diào)控，呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，且細胞分化較為徹底。近年，有研究者成功建立了一種永生化神經(jīng)干細胞系，通過轉染技術將外源性人端粒酶催化亞單位基因導入體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞中，建立了永生化神經(jīng)干細胞系，這種神經(jīng)干細胞不僅保存了基本特性，而且在長期的體外培養(yǎng)中可傳至50代仍生長旺盛，分裂速度更加地迅速，可作為種子細胞。永生化神經(jīng)干細胞作為合適的體外轉基因治療載體，較普通神經(jīng)干細胞具有更多的優(yōu)勢：(1)永生化神經(jīng)干細胞較普通干細胞具有良好的安全性，研究表明移植治療中，永生化的細胞在移植體中與組織地嵌合十分完整;(2)移植治療當中不需要特殊的免疫反應藥物，不引起免疫反應;(3)永生化細胞作為基因治療的靶細胞時，較普通干細胞更具有穩(wěn)定性，基因表達更具備高效性;(4)目前研究表明利用藥物控制的永生化神經(jīng)干細胞表達系統(tǒng)，可調(diào)節(jié)被施加外源性作用因子調(diào)節(jié)的轉移基因的表達;(5)永生化神經(jīng)干細胞可控性較普通神經(jīng)干細胞有較大地提高;(6)符合倫理道德。盡管，永生化神經(jīng)干細胞的建立，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療帶來了新的希望，但我們也應該意識到正常細胞的基因組以及某些遺傳性狀被改變之后才能制備成永生化細胞，對其應用價值有待于進一步評價。
2 神經(jīng)干細胞研究的問題與展望
綜上所述，基因修飾等技術構建的工程化神經(jīng)干細胞能顯著提高移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果。但是，目前利用基因工程技術構建的神經(jīng)干細胞，在的移植治療技術中尚屬開端，其仍然面臨各種的難題：(1)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的復雜較為特殊，在治療過程的當中需要多種基因的參與，一種或兩種基因的參與難以完成;(2)針對永生化神經(jīng)干細胞，它是由正常細胞的基因組以及某些遺傳性狀被改變之后才被制備而成的，對其生理機制及應用價值有待進一步研究與評估;(3)研究用神經(jīng)干細胞大部分經(jīng)胚胎干細胞培養(yǎng)而來，其來源尚有理論爭議;(4)工程化神經(jīng)干細胞在移植入人體后，其存活、分化、遷移通過何種指標能夠明確顯示，這還需要進一步的研究。總之，工程化神經(jīng)干細胞的前途是美好的，它在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)面的價值終會得到體現(xiàn)。
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