pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒的構建研究論文

　　應激蛋白Argonaute1是一種多功能蛋白，參與RNA干擾及應激顆粒(SGs)、加工體(PBs)形成等多種細胞生物學過程。pmCherry-C1是一種可以編碼紅色熒光蛋白的真核表達載體。2015年9～11月，本研究通過基因工程技術將Argonaute1基因片段連接至pmCherry-C1載體，構建pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒，旨在為深入研究Argonaute1蛋白的細胞生物學功能提供便利工具。

　　1材料與方法

　　1.1材料質粒、菌株及細胞:pmCherry-C1載體由JohanPerane博士饋贈，感受態(tài)大腸桿菌Trans1購自天津科儀嘉欣科技有限公司，HeLa細胞來自本實驗室。酶類及主要生化試劑:限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4DNA連接酶均購自ThermoFisherScientific公司，Taq酶購自北京鼎國昌盛生物技術公司，T/A載體(pEASY-T1)購自北京全式金生物技術有限公司，B型小量DNA快速回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限公司，質粒快速提取試劑盒購自北京索來寶科技有限公司，去內毒素質粒提取試劑盒購自Promega公司，Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，BCA蛋白檢測試劑盒購自Pierce公司，LumiGLo化學發(fā)光底物購于KPL公司。抗體:兔抗人Argonaute1單克隆抗體購自CST公司，鼠抗人G3BP單克隆抗體和兔抗人DCP1α抗體購自abcam公司，鼠抗人櫻桃紅蛋白(Cherry)單克隆抗體購自MBL公司，藍色熒光(AlexaFluor350)標記的驢抗鼠熒光二抗和綠色熒光(AlexaFluor488)標記的驢抗兔熒光二抗購自Invitrogen公司，辣根過氧化物酶標記的抗鼠和抗兔IgG二抗購自KPL公司。引物合成及基因測序由北京天一輝遠公司完成。

　　1.2pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒構建

　　1.2.1Argonaute1蛋白目的片段獲取提取HeLa細胞的總RNA，以TGGACCAAAAGGGGCAGCACTGGTGCCC序列進行Argonaute1的cDNA擴增;根據(jù)CDS序列(NM012199.2)設計含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶位點的引物序列，即F:5'-CCGGAATTCCATGGAAGCGGGACCCTCGGGAG-3';R:5'-CGCGGATCCTCAAGCGAAGTACATGGTGCGCA-3';以反轉錄的Argonaute1cDNA為模板，擴增PCR目的片段，條件為95℃預變性5min，95℃30s、65℃45s、72℃3min，共15個循環(huán)，每次循環(huán)降低1℃，再以50℃進行20個循環(huán)，72℃延伸10min;將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，并將目的片段與pEASY-T1(T/A載體)于25℃連接15min。連接產物轉化Tran1-T1感受態(tài)細胞，置于含有氨芐/卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取質粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化目的片段。

　　1.2.2線性pmCherry-C1質粒載體獲取以質粒快速小提試劑盒提取pmCherry-C1質粒，進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，完整切下呈線性的pmCherry-C1質粒載體，以1%瓊脂糖電泳分離，再以凝膠回收試劑盒回收pmCherry-C1線性載體(約4700bp)。在T4DNA連接酶作用下，將線性pmCherry-C1質粒載體與具有相同黏性末端的Argonaute1功能片段于22℃下連接并過夜。連接產物轉化感受態(tài)細菌大腸桿菌Trans1，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴增并提取重組質粒。

　　1.3pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒鑒定

　　1.3.1酶切及基因測序采用EcoRⅠ和BamHⅠ對重組質粒pmCherry-C1-Argonaute1進行單、雙酶切鑒定，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證片段大小;同時對重組質粒進行基因測序鑒定。

　　1.3.2融合蛋白檢測采用Westernblotting法。以預冷的1×NP-40裂解液裂解細胞，超聲破碎細胞后4℃、12000r/min離心10min，取上清獲取全細胞裂解液，以BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。裂解液中加入SDS上樣緩沖液(pH6.8的50mmol/LTris-Cl、2%SDS、0.1%溴酚藍、10%甘油、2.5%β-巰基乙醇)，99℃熱變性10min，8%SDS-PAGE電泳;以半干轉法將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉3h;加入兔抗人Argonaute1單克隆一抗或鼠抗Cherry一抗，4℃孵育過夜;TBST溶液洗膜3次，每次10min;加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG二抗室溫孵育2h;TBST溶液再次洗膜3次，每次10min;加入LumiGLo化學發(fā)光底物后暗室曝光。

　　1.3.3三色熒光共定位分析以去內毒素質粒提取試劑盒提取無內毒素重組質粒。將細胞接種于激光共聚焦皿中，以含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞達80%融合時，進行脂質體瞬時轉染pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒。轉染后48h給予0.5mmol/L亞砷酸鹽處理1h，以4%多聚甲醛室溫固定10min，以高壓過的PBS緩沖液洗滌2次、5min/次。以1%通透液(含0.2%TritonX-100的PBS)室溫靜置通透10min;加入1%BSA封閉1h;加入G3BP(1∶250)和DCP1α(1∶100)一抗混合液，4℃孵育過夜;PBS洗滌3次，10min/次;加入藍色熒光標記驢抗鼠(1∶800)與綠色熒光標記驢抗兔(1∶800)二抗混合液，4℃孵育過夜;PBS洗滌3次，10min/次。以不含DAPI的細胞熒光封片液封片并過夜，以激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內紅、綠、藍三色熒光信號。

　　2結果

　　2.1Argonaute1目的片段PCR擴增目的片段長度約為2574bp。

　　2.2線性pmCherry-C1質粒載體完整的線性pm-Cherry-C1質粒載體經EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后，在4722bp左右出現(xiàn)條帶，純化回收后用于后續(xù)的連接反應。

　　2.3重組真核表達質粒pmCherry-C1-Argonaute1鑒定結果

　　2.3.1酶切及基因測序將構建的重組質粒分別進行EcoRⅠ和BamHⅠ的單、雙酶切，產生的條帶大小與預期相符，重組質粒基因測序結果正確，證明Argonaute1功能片段已成功插入到pm-Cherry-C1的多克隆位點上。

　　2.3.2融合蛋白表達Argonaute1蛋白、Cherry蛋白融合后分子量為89.7KDa，Westernblotting法檢測的蛋白條帶與目的融合蛋白分子量相符，表明Cherry-Argonaute1融合蛋白表達成功。

　　2.3.3三色熒光共定位轉染構建的重組質粒pmCherry-C1-Argonaute1，可在細胞內發(fā)現(xiàn)熒光信號，當細胞受到氧化應激時Cherry-Argonaute1可在胞質內形成紅色的顆粒狀結構，與SGs的標志蛋白G3BP(藍色)、PBs的標志蛋白DCP1α(綠色)顆粒結構均呈共定位關系。

　　3討論

　　Argonaute1蛋白家族是一類相對分子量約為100KDa的序列保守蛋白，表達于人、果蠅、擬南芥等多個物種。Argonaute1蛋白家族包括多個成員，多含有月牙狀的PAZ和具有潛在核酸內切酶活性的PIWI結構域，參與miRNA、siRNA、piRNA等多個非編碼小RNA的細胞生物學過程。研究發(fā)現(xiàn)，Argonaute1是RNA誘導沉默復合體的核心元件，與siRNA生成、靶mRNA降解、細胞應激等過程密切相關。生物體的生存環(huán)境復雜多變，機體細胞為應對氧化應激、滲透壓休克、熱休克、紫外線輻射和病毒感染等多種外界刺激而建立相應的“應激反應體系”，以保持細胞旺盛的生命力。轉錄后基因調控機制是其中至關重要的環(huán)節(jié)，它可調控胞質內RNA代謝、暫時抑制應激細胞中蛋白的翻譯過程、節(jié)省細胞內合成代謝的原料和能量、優(yōu)先表達應激所特需的蛋白等。SGs和PBs是細胞受到應激時在胞質內形成的與RNA代謝密切相關的顆粒狀結構。這兩種顆粒結構實質上是一系列蛋白、核酸的聚集體。隨著研究的深入，不斷有新的應激蛋白被發(fā)現(xiàn)。

　　其中，Argonaute1蛋白同時參與細胞中SGs和PBs的形成。通過基因工程的方法對Argonaute1蛋白進行熒光蛋白標記，可用于探討Argonaute1蛋白在細胞應激中的作用。Cherry是四聚體Discosomasp.紅色熒光蛋白的一個突變體，熒光強度及抗光漂白能力均有所提高。pmCherry-C1載體允許目的基因片段插入Cherry蛋白基因的C端，形成紅色熒光標記的目的蛋白。本研究通過構建pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒的方法對Argonaute1蛋白進行Cherry的熒光標記。在Westernblotting實驗中發(fā)現(xiàn)，利用抗內源性Argonaute1抗體可以檢測出兩個條帶，而抗Cherry抗體檢測出一個條帶，表明pmCherry-C1-Argonaute1重組質粒能夠在活細胞內成功表達Cherry與Argonaute1的融合蛋白。當細胞受到亞砷酸鹽氧化應激刺激時，Cherry標記的Argonaute1蛋白可與應激顆粒(以G3BP蛋白為標記蛋白)和加工體(以DCP1α為標記蛋白)均呈共定位關系，說明Argonaute1蛋白為細胞應激和加工體的共同成員。

　　總之，本研究成功構建了重組pmCherry-C1-Argonaute1質粒，其可有效表達Cherry標記的Argonaute1融合蛋白;上述結果有助于深入研究Argonaute1蛋白在細胞應激及相關疾病研究領域的生物學作用機制。

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