蛋白激酶在缺血大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的保護(hù)作用論文
研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷是對(duì)組織造成損傷的主要因素，即再次恢復(fù)血液供應(yīng)，缺血組織灌注時(shí)造成的微血管和實(shí)質(zhì)器官的損傷，本研究旨在探討糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1( SGK1) 在大腦缺血再灌注過(guò)程中可能的保護(hù)機(jī)制。
1 資料和方法
1. 1 樣本來(lái)源本研究用細(xì)胞為培養(yǎng)后的1 日齡SD 大鼠神經(jīng)元細(xì)胞。對(duì)SD 大鼠采用椎脫臼處死法處死，用75% 酒精浸泡消毒3 ～ 5 min; 取出海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
1. 2 試驗(yàn)方法
1. 2. 1 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的額分離及培養(yǎng)選用1 日齡SD大鼠2 只。通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行消毒后處死，獲取了SD 大鼠的海馬細(xì)胞，并進(jìn)行了體外培養(yǎng)。
1. 2. 2 已分離培養(yǎng)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的'免疫熒光鑒定采用海馬神經(jīng)元特異性抗微管相關(guān)蛋白2(MAP2) 抗體免疫熒光來(lái)顯示分離和培養(yǎng)的結(jié)果，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，記錄每個(gè)視野中染色陽(yáng)性的細(xì)胞占所有細(xì)胞的比值，超過(guò)95%的為陽(yáng)性。
1. 2. 3 通過(guò)氧糖剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡將海馬神經(jīng)元細(xì)胞根據(jù)氧糖剝奪誘導(dǎo)時(shí)間不同分為正常海馬神經(jīng)元細(xì)胞組，氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min 組、氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min 后正常恢復(fù)10 min組、氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min 后正常恢復(fù)30 min 組和氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min 后正常恢復(fù)60 min 組。采用Annexin VFITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，區(qū)分實(shí)驗(yàn)樣本中正常、壞死、凋亡細(xì)胞。
1. 2. 4 Western 印跡技術(shù)檢測(cè)上述步驟中各種細(xì)胞的SGK1 表達(dá)實(shí)驗(yàn)對(duì)樣本進(jìn)行總蛋白提取與定量，根據(jù)SGK1 的mRNA序列( 序列號(hào): NM_001193568. 1) 設(shè)計(jì)了該基因的全基因引物，獲得目的基因SGK1 模板，構(gòu)建質(zhì)粒載體，并進(jìn)行過(guò)表達(dá)效率檢測(cè)。
1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16. 0 進(jìn)行分析。
2 結(jié)果
2. 1 氧糖剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡及SGK1 表達(dá)情況NC 代表未經(jīng)任何處理的培養(yǎng)過(guò)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞、OGD 表示對(duì)培養(yǎng)過(guò)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行了120 min 的氧糖剝奪，而10 min 組、30 min 組和60 min 組則表示培養(yǎng)過(guò)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞在進(jìn)行了120 min 的氧糖剝奪之后分別進(jìn)行了10 min、30 min 和60 min 的氧糖正常供給。
2. 2 SGK1 基因蛋白水平的過(guò)表達(dá)能阻止氧糖剝奪120 min 的培養(yǎng)過(guò)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡與NC 組比較，轉(zhuǎn)染SGK1 過(guò)表達(dá)載體的細(xì)胞內(nèi)，可以SGK1 導(dǎo)致mRNA 的表達(dá)增加約5 倍; 在轉(zhuǎn)染了SGK1 過(guò)表達(dá)病毒載體的細(xì)胞中，SGK1 基因在蛋白水平的表達(dá)約超過(guò)未處理組的2. 5倍。海馬神經(jīng)元分別轉(zhuǎn)染了空載體或編碼SGK1 基因的表達(dá)載體; 在轉(zhuǎn)染24 h 后，
SGK1 在基因水平和蛋白質(zhì)水平的變化情況和NC 相比具有顯著性差異。海馬神經(jīng)元分別轉(zhuǎn)染了空載體或編碼SGK1 基因的表達(dá)載體24 h，然后進(jìn)行120 min 的氧糖剝奪，然后使之恢復(fù)60 min; 運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析用膜聯(lián)蛋白V/PI 雙染色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGK1 和活化的金屬基質(zhì)蛋白酶(caspase) -3 蛋白水平差異情況。
3 討論
缺血性腦血管病是目前導(dǎo)致人類，尤其是老年人致死和致殘率最高的疾病之一。對(duì)于缺血性腦血管病當(dāng)前最主要的治療原則是對(duì)缺血區(qū)域進(jìn)行血液灌注; 然而近期發(fā)現(xiàn)對(duì)缺血性腦血管疾病的缺血再灌注非但沒有使組織功能恢復(fù)，反而會(huì)導(dǎo)致缺血所致的功能障礙和結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重，這種現(xiàn)象即缺血再灌注損傷，在各種模式生物和人類研究中都得到了一致的結(jié)果。
本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)體外培養(yǎng)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪可導(dǎo)致SD 海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量的增加，而之后隨著再恢復(fù)氧糖供應(yīng)時(shí)間的增加，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的數(shù)據(jù)則呈現(xiàn)進(jìn)一步加劇的趨勢(shì)。而SGK1 的過(guò)表達(dá)則可以抑制SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞因氧糖剝奪導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)。另外本結(jié)果顯示，SGK1 的過(guò)表達(dá)能顯著降低因氧糖剝奪導(dǎo)致的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的數(shù)量，這一結(jié)果得到了熒光輔助細(xì)胞篩選分析的支持，提示Akt 和GSK-β 可對(duì)經(jīng)受缺血再灌注海馬神經(jīng)元細(xì)胞能起到保護(hù)作用。
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