深究RDP多肽修飾的姜黃素隱形脂質的作用論文

　　治療腦內疾病的必要途徑需將藥物靶向性輸送入腦內。以腦靶向性的蛋白或多肽作為載體，可能會實現藥物的腦靶向轉運。我們實驗室以往的研究表明，狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein，RVG)的衍生肽RDP(RVG-derivedpeptide)，可攜帶核酸、蛋白等生物大分子入腦。脂質體是一種安全有效的藥物遞送方式。脂溶性化合物可被包裹在脂質體內核中，在體內安全釋出以發揮作用。此外，脂質體較易修飾，從而可使其具有靶向性和高效性。本研究將在脂質體表面的PEG鏈端連接RDP多肽，以具有抗腫瘤效果的天然植物提取物姜黃素為模型藥物，研究該RDP修飾脂質體的腦靶向作用，從而可能為向腦內送脂溶性化合物以治療腦部疾病，提供一種嶄新的途徑和方法。

　　1 材料與方法

　　1.1 試劑

　　姜黃素，純度>98%，購自美國Sigma公司;大豆卵磷脂、膽固醇，純度>95%，均購自上海Aladdin公司;DSPE-PEG-NHS(PEGMW 2000)，購自美國Nanocs公司;Cys-RDP，純度>95%，購自上海吉爾公司;乙酸乙酯、乙腈、冰醋酸均為色譜純。

　　1.2 儀器

　　高效液相色譜儀(包含SPD-M20A檢測器和LC-20AD泵)，購自日本島津公司;激光粒度及zeta電位分析儀(NanoZS)，購自英國馬爾文公司;生物質譜儀autoflexspeedMALDI-TOF/TOF，購自德國BrukerDaltonic公司;AB135-S電子分析天平，購自瑞士梅特勒-托利多公司;BF-2000氮氣吹干儀，購自上海八方世紀科技有限公司;XHF-D高速分散器，購自寧波新芝生物科技有限公司。

　　1.3 細胞株及培養體系

　　人腦星形膠質母細胞瘤細胞U-87MG(實驗室凍存)，采用含10%胎牛血清的DMEM-H培養基培養，置于37℃、5%CO2、飽和濕度下的培養箱內。隔天換液，待細胞密度長至80% ～90%時，按照1∶3的比例傳代。傳代時，加入消化液一定時間后去除，用培養基吹打成單個細胞懸液，取生長良好、活性大于98%的細胞進行后續實驗。

　　1.4 實驗動物

　　昆明小鼠80只，♂各半，體質量(20±2)g，購自于重慶滕鑫生物技術有限公司。小鼠飼養于西南大學藥學院SPF小鼠飼養室，恒溫、恒濕，自由進食、進水。

　　1.5 脂質體的制備和表征

　　1.5.1 導向化合物的合成

　　按照摩爾比2∶1的比例精密稱取DSPE-PEG-NHS和RDP溶于DMF中，然后加入20μL的N-甲基嗎啉，置于4mL離心管中，在攪拌器中避光攪拌48h。取出反應液，置于透析袋(MW 3500)中，放入2L去離子水中透析48h后(每6h換水1次)，冷凍干燥，-20℃保存。

　　1.5.2 脂質體的制備

　　采用薄膜分散法分別制備姜黃素脂質體(CUR-L)和RDP修飾的姜黃素隱形脂質體(RDP-CUR-L)。按照處方量(Tab1)精密稱取各種脂材于10mL茄形瓶中，加入氯仿3mL溶解，37℃減壓旋轉蒸發10min，使其成均勻的薄膜。然后加入1mL去離子水，37℃于水浴搖床中水化1h，形成懸浮液，間歇超聲90s，得到澄清透明呈淡黃色乳光的`脂質體溶液，并分別過100nm的膜使粒徑分布均勻，4℃冰箱內保存。

　　1.5.3 DSPE-PEG-RDP比例篩選

　　按上述脂質體制備方法制備一系列含不同比例DSPE-PEG-RDP的含藥靶向脂質體(DSPE-PEG-RDP分別為總摩爾量的0.5%、1.0%、2.0%和5.0%)。采用MTT法考察不同密度下的RDP-CUR-L對U87MG細胞抑制率的影響。取對數生長期狀態良好的細胞，用0.25%胰酶消化液消化后，調整細胞濃度為5×107·L-1，以每孔500μL(5000個/孔)接種于96孔板，培養24h貼壁后加入不同濃度的CUR-L和RDP-CUR-L，濃度依次為150、75、37.5、18.8、9.4、4.7μmol·L-1，孵育48h后，棄去培養基，每孔加入濃度為5g·L-1的MTT(20μL)，37℃培養4h，棄去培養液，每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)溶解藍紫色甲#顆粒，用酶標儀在波長為490nm下測定光吸收值(OD)。每組實驗重復3次，每個樣品做3個平行樣。全部實驗均設DMSO對照組。

　　1.5.4 脂質體粒徑、電位、分散度測定

　　用激光粒度及zeta電位分析儀分別測定CUR-L和RDP-CUR-L的粒徑、Zeta電位、分散度(PDI)。1.5.5 脂質體包封率測定 采用透析破乳法，取用均質機處理過的CUR-L和RDP-CUR-L，每組實驗分成兩份(每份400μL)：一份用透析液透析6h后，收集脂質體部分，以10%的TritonX-100破乳，經HPLC測定包裹在脂質體內的藥物濃度C;另一份直接破乳，經HPLC測定姜黃素得到C0，按照公式計算出包封率(包封率=C/C0×100%)。

　　1.5.6 脂質體穩定性考察

　　取制得的CUR-L和RDP-CUR-L，分成兩個實驗組，每組平行3次，分別于3、7、15、30、45、60d后肉眼觀察脂質體溶液變化，HPLC測包封率。

　　1.5.7 體外釋放度測定

　　采用動態透析法(dynam-icdialysis)，按中國藥典2010版附錄XC第三法(小杯法)測定釋放度。精密量取制劑CUR-L、RDP-CUR-L各0.5mL，經釋放介質稀釋至3mL，裝于透析袋內(截留分子質量為8000u)，兩端扎牢，放入150mL釋放介質中，釋放介質為含有0.2%十二烷基硫酸鈉的人工胃液，37℃ 下姜黃素在此釋放介質中的溶解度為80mg·L-1，滿足漏槽條件。37℃恒溫水浴攪拌(轉速為100r· min-1)。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24h各個時間點取樣0.3mL，并及時補充等溫的相同體積空白介質。微孔濾膜過濾，按照HPLC方法檢測姜黃素含量，并計算累積釋藥百分率(%)。

　　1.6 姜黃素懸浮液和脂質體的體內分布

　　1.6.1 色譜條件

　　C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm，大連依利特分析儀器公司);流動相：乙腈∶4%冰醋酸(48∶52)，流速：1mL·min-1，檢測波長：430nm，柱溫：25℃。

　　1.6.2 樣品預處理

　　將姜黃素溶解于1%羧甲基纖維素鈉中，配制成濃度為1g·L-1的CUR混懸液，制得的CUR-L和RDP-CUR-L濃度均為1g·L-1，CUR、CUR-L、RDP-CUR-L均按照姜黃素30mg·kg-1的劑量于小鼠尾靜脈注射給藥。取昆明小鼠，禁食12h，尾靜脈分別注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L，于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12h各個時間點分別取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦(每個時間點3只)，用生理鹽水清洗后用濾紙吸干，剪碎，精密稱重，加入1mL生理鹽水，用組織勻漿器勻漿，加入1mL乙酸乙酯，渦旋3min，3000r·min-1離心10min，精密吸取上清液，再加入相同體積的乙酸乙酯，萃取2次，合并上清液，氮氣吹干，加入10倍體積的流動相，超聲、渦旋使其充分溶解，過膜后進樣。

　　1.6.3 方法學考察

　　專屬性：取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦各空白組織勻漿液0.3mL，樣品處理后采用HPLC法分別進樣測定空白樣品、空白樣品加內標及小鼠尾靜脈注射給藥后的樣品。標準曲線：取小鼠空白組織勻漿液，精密加入姜黃素標準溶液，配制成1.6、3.1、6.2、12.5、25、50mg·L-1系列濃度的樣品溶液，樣品處理后，以姜黃素的峰面積與樣品中姜黃素的濃度(C)進行線性回歸。回收率與精密度：配制低、中、高濃度(3、12.5、50mg·L-1)的姜黃素質控樣品，各5份，按“樣品處理”項下方法處理，進樣測定。以姜黃素的峰面積代入標準曲線方程，計算出姜黃素的濃度，與實際加入量比較，計算方法回收率，用以表示準確度;以相應低、中、高濃度的姜黃素對照品溶液直接進樣，以質控樣品中姜黃素峰面積與對照品溶液中姜黃素峰面積比較，計算提取回收率;1d內進樣測定5次，連續測定5d，計算日內RSD和日間RSD。

　　2 結果

　　2.1 脂質體的制備和表征

　　2.1.1 導向化合物的合成

　　生物質譜分析反應產物DSPE-PEG-RDP的結果如Fig1所示。RDP相對分子質量為3671，DSPE-PEG-NHS分子質量為3094，得到的產物DSPE-PEG-RDP相對分子質量約為6800，說明導向化合物制備成功。

　　2.1.2 脂質體的粒徑、zeta電位、分散度及包封率

　　CUR-L和RDP-CUR-L粒徑、zeta電位、分散度和包封率如Tab2所示。結果表明，CUR-L粒徑為(81.20±5.13)nm，而RDP-CUR-L經RDP修飾過后粒徑為(98.56±6.97)nm，分散性良好，包封率均大于85%，制備重現性較好。

　　2.1.3 脂質體穩定性

　　CUR-L和RDP-CUR-L4℃冰箱放置60d后，溶液依舊澄清透明，呈淡黃色乳光，與新制備時相比無明顯變化。不同時間點測其包封率，可以看出RDP修飾對姜黃素脂質體包封率影響不大，60d后CUR-L和RDP-CUR-L的包封率仍然在80%左右，可見穩定性良好。

　　2.1.4 導向化合物DSPE-PEG-RDP比例篩選

　　，當加入的DSPE-PEG-RDP為總摩爾量的1.0%時，RDP-CUR-L對U87細胞的抑制作用明顯優于CUR-L(P<0.01)。隨著DSPE-PEG-RDP比例的增加，U87細胞的存活率逐漸降低，這表明在脂質體的PEG鏈端連接RDP能增強對U87細胞的抑制作用，當加入比例達5.0% 時，RDP-CUR-L對U87細胞的抑制作用最強，與0.5%時相比差異有顯著性(P<0.05)。當比例超過1%時，RDP-CUR-L對U87細胞的抑制變化不明顯，表明繼續增加DSPE-PEG-RDP的量并不能提高RDP-CUR-L對U87細胞的抑制率。密度篩選實驗結果表明，DSPE-PEG-RDP的加入比例能影響脂質體的靶向效率。出于實驗效果和經濟性考慮，選取加入比例為1.0%進行以下的實驗。

　　2.1.5 體外藥物釋放

　　由于姜黃素在水中幾乎不溶解，采用加入2% 十二烷基硫酸鈉(SDS)的人工胃液為釋放介質，考察姜黃素制劑的釋藥情況。CUR-L在前6h內大量釋放，累計釋放量接近60%，而后進入慢速釋放期，12h釋放量約為80%，而RDP-CUR-L釋放在該釋放介質中較慢，6h后釋放約45%，24h后累積釋放量不到80%，表明RDP-CUR-L有著更好的緩釋作用。

　　2.2 姜黃素懸浮液和脂質體的體內分布

　　2.2.1 方法學考察

　　在上述色譜條件下，方法專屬性良好，峰形良好，保留時間約為14min，組織中的內源性物質不干擾樣品測定。樣品中的姜黃素在1.5625～50mg·L-1線性關系良好(r=0.9994)。方法回收率為(95.87±4.98)%，高、中、低3個濃度的提取回收率分別為(94.79±1.94)%、(95.26±2.87)% 和(95.18±1.78)% (n=5)，日內精密度和日間精密度小于15%，均符合生物樣品分析方法的要求。

　　2.2.2 體內分布和腦靶向作用考察

　　小鼠尾靜脈注射CUR、CUR-L、RDP-CUR-L后不同時間各組織中的姜黃素。注射CUR后，隨著時間的推移，姜黃素在各個臟器中含量逐漸減少，姜黃素大量分布在肺、肝、腎等臟器中，心、脾中也有少量分布，然而由于血腦屏障的作用，腦部并未檢測到姜黃素。注射CUR-L后，由于易被網狀內皮系統吞噬，姜黃素主要分布在肝、腎、肺中，在腦、脾中少量分布，而在心臟中沒有檢測到姜黃素。RDP-CUR-L經尾靜脈給藥后大致分布與CUR-L類似，但在腦中檢測到大量的姜黃素，并且在小鼠體內的滯留時間明顯延長，24h仍然能在腦中檢測到姜黃素。

　　3 討論

　　脂質體作為藥物載體具有使藥物被動靶向網狀內皮系統、延長藥物作用時間、減少藥物不良反應、提高療效等優點。表面經柔性高分子PEG修飾，增大了脂質體的空間位阻，同時提高了膜表面親水性，使得其不易被網狀內皮系統(reticularepithelialsystem，RES)攝取，因而PEG化的脂質體較普通脂質體更長效。

　　雖然脂質體經PEG修飾后能夠延長在體內的循環時間，增加在腫瘤組織中的聚集，但是由于“PEGdilemma”現象的存在，阻礙了腫瘤細胞對脂質體的內吞，故在脂質體的PEG鏈端連接靶向配體如葉酸、轉鐵蛋白、抗-EGFR抗體等，使得靶向配體與腫瘤細胞過度表達的受體特異性結合，通過“配體-受體”特異性識別與結合作用，能夠促進細胞對載體的吞，增加藥物的抗腫瘤效果，并且可以定向地將藥物運送到靶部位，實現對腫瘤組織的“主動靶向”。脂質體或者納米粒子表面修飾特異性配體或受體，主動靶向特定腫瘤組織的文獻已有大量報道。一些常見的細胞穿膜肽，如TAT、多聚Arg、轉運素，已被證實能夠在體外將核酸、蛋白等小分子物質轉導入培養的細胞。Khafagy等研究發現，L-型穿膜肽penetratin可以明顯增加胰島素的滲透性，從而使其穿過鼻膜，并不會對鼻吸收黏膜上的細胞完整性造成明顯的破壞。據文獻報道，另一個從狂犬病毒糖蛋白衍生出的一個小肽與多聚Arg連接后，能夠輸送siRNA靶向性地進入中樞神經系統，導致相關基因沉默。KaiPharmaceutical公司應用Tat引導蛋白激酶C抑制劑的蛋白調節子，用于腦缺血和急性心肌缺血的治療，并且已于2007年進入了Ⅱ期臨床試驗。

　　然而，用細胞穿膜肽引導脂質體等納米載體進入特定的組織，特別是腦組織的文獻卻并不多見。普通CPPs雖然能介導各類分子入胞，但是其缺乏細胞特異性，而本實驗中所用的細胞穿膜肽RDP是一種來源于狂犬病毒糖蛋白RVG，并經過結構改造而得到的一種能靶向中樞神經系統、具有很強嗜神經性的衍生肽，同時具有良好的穿膜特性和對神經細胞的高度選擇性。實驗室前期研究已表明RDP能夠引導核酸、多肽等小分子物質入腦，而本實驗中通過體內分布實驗證明了RDP連接的姜黃素脂質體在體內運輸過程中沒有發生斷裂，確實能夠攜帶包裹了姜黃素的脂質體入腦，不僅僅擁有理論意義，也具有潛在的應用價值。這為腦部疾病的治療提供了新的思路。