探究酵母菌在無(wú)氧條件下發(fā)酵作用產(chǎn)生二氧化碳和酒精。

　　實(shí)驗(yàn)儀器及用品：

　　1.實(shí)驗(yàn)儀器：帶膠塞和膠管的錐形瓶、小氣球、Y形管、大燒杯、溫度計(jì)、試管、比色板、小燒杯、玻璃棒。

　　2.實(shí)驗(yàn)用品:白糖（100g）、一小包干酵母（約30g）、澄清的石灰水、酒精、橙色的重鉻酸鉀溶液。（檢測(cè)酒精的試劑。0.5ml的濃硫酸溶有0.1g重鉻酸鉀，體積分?jǐn)?shù)為95％—97％，在酸性條件下與酒精發(fā)生化學(xué)反應(yīng)由橙色變?yōu)榛揖G色）

　　實(shí)驗(yàn)裝置及說(shuō)明：

　　澄清的.石灰水可以檢測(cè)氣體中有二氧化碳，重鉻酸鉀溶液遇到酒精由橙色變?yōu)榛揖G色。

　　實(shí)驗(yàn)操作：

　　1.將（100ml）40℃溫水倒入錐形瓶，再用湯匙將一大勺糖及適量干酵母加進(jìn)來(lái)，攪拌均勻后，將錐形瓶放在大燒杯中水浴保溫溫度保持在30—40 ℃左右。（先讓酵母菌進(jìn)行有氧呼吸，是酵母菌迅速繁殖，并把葡萄糖分解成二氧化碳和水。）

　　2.觀察到酵母菌培養(yǎng)液有氣泡產(chǎn)生，塞上橡膠塞（這樣做既可以避免氣體散失，影響后面實(shí)驗(yàn)效果，也為酒精的產(chǎn)生提供保障）。過(guò)一段時(shí)間后就可看到干癟的氣球慢慢膨脹起來(lái)了。（酵母菌的無(wú)氧呼吸）

　　3.將夾子打開(kāi)，擠壓氣球，使瓶?jī)?nèi)產(chǎn)生的氣體徐徐通過(guò)膠管導(dǎo)入試管內(nèi)的澄清石灰水中，石灰水變渾濁了(檢測(cè)氣體中有二氧化碳。原理：二氧化碳遇石灰水，石灰水變渾濁)。

　　4.將重鉻酸鉀試劑分別滴在比色板的凹槽內(nèi)，并分別標(biāo)注1號(hào)、2號(hào)（作對(duì)照）、3號(hào)。在3號(hào)試劑上滴1滴酒精，在1號(hào)試劑上滴1滴酵母菌發(fā)酵液。發(fā)現(xiàn)1號(hào)和3號(hào)都由橙色變成了灰綠色。

　　實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)及意義：

　　通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，讓我們對(duì)酵母菌“發(fā)酵現(xiàn)象”所需要的原料、

　　條件及產(chǎn)生的物質(zhì)都有了較直觀的感受，比較容易理解課本上闡述的“酵母菌可以把葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳”等有關(guān)內(nèi)容，而且印象深刻。使我們養(yǎng)成很好的節(jié)約意識(shí)。

　　實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：

　　1.聞到了發(fā)酵后特殊的甜酒的芳香氣味。

　　2.詳見(jiàn)【實(shí)驗(yàn)操作4】

　　3.澄清的石灰水變渾濁

發(fā)酵現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)報(bào)告3

　　一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

　�。�1）掌握搖床發(fā)酵法制備糖化酶的工藝流程及操作方法

　�。�2）了解利用黑曲霉菌菌種發(fā)酵時(shí)的生長(zhǎng)條件及注意事項(xiàng)

　�。�3）熟練掌握實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的無(wú)菌操作和培養(yǎng)條件的選擇

　　二、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

　　菌種：黑曲霉

　　儀器：錐形瓶（500ml)、移液管、恒溫水浴鍋、秒表、50mL比色管、牛皮紙、紗布（8層）、pH計(jì)。

　　藥品：三水乙酸鈉、冰醋酸、硫代硫酸鈉、碘、氫氧化鈉、硫酸、可溶性淀粉、玉米粉、豆餅粉、麩皮

　　三、實(shí)驗(yàn)原理

　　搖瓶發(fā)酵是實(shí)驗(yàn)室常用的通風(fēng)發(fā)酵方法，通過(guò)將裝有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶放在搖床上振蕩培養(yǎng)，以滿足微生物生長(zhǎng)、繁殖及產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物對(duì)氧的需求。它是實(shí)驗(yàn)室篩選好氣性菌種，以及摸索種子培養(yǎng)工藝與發(fā)酵工藝的常用方法。

　　葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）系統(tǒng)名為淀粉α-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗稱糖化酶，是國(guó)內(nèi)產(chǎn)量最大的酶品種。糖化酶對(duì)淀粉分子的作用是從非還原末端切開(kāi)α-1,4鍵，也能切開(kāi)α-1,3鍵和α-1,6鍵，產(chǎn)生葡萄糖。

　　糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原末端開(kāi)始，分解α-1,4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸鈉氧化，過(guò)量的次碘酸鈉酸化后析出碘，再用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，計(jì)算酶活力。

　　四、實(shí)驗(yàn)步驟

　　1.培養(yǎng)步驟

　　1.1種子培養(yǎng)基制備及滅菌

　　將新鮮土豆去皮切塊，稱取200~300 g土豆塊放入500 mL燒杯中，加入一定量水，在電爐上煮沸至土豆塊熟透，用120目紗布過(guò)濾，濾渣反復(fù)用一定量水清洗、過(guò)濾2次，合并各次濾液且定容至1000 mL即得土豆汁。取一定體積的土豆汁，在其中加入5%的蔗糖，溶解搖勻并調(diào)pH至5.5，即得種子培養(yǎng)基。將適量種子培養(yǎng)基倒入錐形瓶（250ml），用紗布塞塞住管口，并用牛皮紙包扎，置滅菌鍋中，于121℃下滅菌30min。待滅菌完畢，冷卻取出。

　　1.2發(fā)酵培養(yǎng)基制備及滅菌

　　取6只500mL搖瓶，分別按裝液量100、200、300mL配制培養(yǎng)基（玉米粉6%、豆餅粉2%、麩皮1%），加水后稍微搖動(dòng)，使原料濕潤(rùn)，浸入水中。用8層紗布包扎瓶口，再加牛皮紙包扎。置滅菌鍋中，于121℃下滅菌30min。

　　1.3發(fā)酵培養(yǎng)基接種：將已生長(zhǎng)好的菌種，在無(wú)菌條件下，按照10%的接量（8%-12%）接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上。

　　1.4發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵：將搖瓶固定在搖床上，培養(yǎng)溫度為31℃，轉(zhuǎn)速為120r/min，培養(yǎng)時(shí)間96h。顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，用試紙測(cè)發(fā)酵液pH，測(cè)定酶活力。搖瓶培養(yǎng)時(shí)觀察各種搖瓶機(jī)的結(jié)構(gòu)。

　　2.糖化酶活力測(cè)定

　　2.1待測(cè)酶液的制備：

　　精確吸取液體酶1.00mL，先用少量的乙酸緩沖液溶解，并用玻璃棒搗研，將上清液小心傾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量緩沖液，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度（估計(jì)酶活力在100~250u/mL范圍內(nèi)），搖勻。通過(guò)4層紗布過(guò)濾，濾液供測(cè)定用。

　　2.2酶活力測(cè)定：

　　于甲、乙兩支50mL比色管中，分別加入可溶性淀粉溶液25mL及緩沖液5mL，搖勻后，于40℃恒溫水浴中預(yù)熱5min。在甲管（樣品）中加入待測(cè)酶液2mL，立刻搖勻，在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，立刻各加入氫氧化鈉溶液0.2mL，搖勻，將兩管取出迅速冷卻，并于乙管（空白）中補(bǔ)加待測(cè)酶液2mL。吸取上述反應(yīng)液與空白液各5mL，分別置于碘量瓶中，準(zhǔn)確加入碘溶液10mL，再加氫氧化鈉溶液15mL，搖勻塞緊，于暗處反應(yīng)15min。取出，加硫酸溶液2mL，立即用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定，直至藍(lán)色剛好消失為其終點(diǎn)。

　　2.3酶活力計(jì)算：

　　樣品酶活力（u/g或u/mL）=579.9×(A-B)c×n式中：A與B分別為空白、樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；c為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；n為稀釋倍數(shù)。

　　五、數(shù)據(jù)分析

　　比較不同裝液量下的菌體形態(tài)特征、酶活力，將結(jié)果填入下表：

　　裝液量/mL

　　指標(biāo)

　　酶活力

　　pH

　　菌體特征 100 420u/mL 4.2 200 510u/mL 4.1 300 570u/mL 3.8 出現(xiàn)球狀的白色的菌絲團(tuán)，瓶壁上出現(xiàn)黑絲的.孢子和菌絲

　　六、結(jié)論

　　1.不同的裝液量對(duì)酶活力的影響是隨著裝液量的增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但是酶活力變化不大，并且酶活力不高，與其他組數(shù)據(jù)相比接種量跟酶活力關(guān)

　　2.菌體特征在錐形瓶的瓶壁上出現(xiàn)白色的菌絲，在培養(yǎng)基中也出現(xiàn)了絲球

　　3.菌種新陳代謝的旺盛二氧化碳的釋放增加，使pH值逐漸下降，最終使培養(yǎng)基的pH下降至3.8左右。

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